المحتوى
- مراحل
- طريقة 1 من 3: التعرف على البكتريا بواسطة صبغة الجرام
- طريقة 2 من 3: إجراء اختبار تلطيخ زيل-نيلسن
- الطريقة الثالثة: دراسة سلوك ومظهر البكتيريا
- الطريقة الرابعة: تفسير جميع النتائج
تحديد البكتيريا مهمة معقدة. أحد الأسباب هو أنه وفقًا للتقديرات ، يوجد ما بين 10 آلاف إلى مليار نوع بكتيري في العالم! من المهم للغاية تحديد البكتيريا بشكل صحيح ، لا سيما في المجال الطبي ، حيث يعتمد العلاج المناسب للمرض إلى حد كبير على نوع الميكروب الذي يسبب المشكلة. في معظم الحالات ، يتم تحديد الهوية على أساس القضاء. لتحديد البكتيريا ، يجب إجراء اختبارات تلطيخ ، وتحليل مظهرها ومراقبة كيفية استجابتها بشكل جيد لظروف مختلفة. إذا كنت بحاجة إلى نتيجة سريعة ، فاخذ عينة من الحمض النووي لإرسالها إلى المختبر.
مراحل
طريقة 1 من 3: التعرف على البكتريا بواسطة صبغة الجرام
- حدد إذا كانت البكتيريا إيجابية الجرام أو سلبية. تلطيخ الجرام هو وسيلة لتقسيم البكتيريا بين النوعين الأكثر شيوعًا: الجرام إيجابي وسالب الجرام. يحتوي الأول على جدار خلوي سميك يتكون من بوليمر يسمى ببتيدوغليكان ، والذي يحتوي على أفضل تلطيخ مثل الجدران الرقيقة للبكتيريا سالبة الجرام.
- بعض الأنواع الشائعة من البكتيريا إيجابية الجرام هي المكورات العقدية ، والمكورات العنقودية ، والعقاقير الصغيرة (أو المكورات الدقيقة) والليستيريا.
- فيما يلي بعض الأمثلة الشائعة عن البكتيريا سالبة الجرام: النيسرية ، Acinetobacter ، Moraxella ، Enterobacteriaceae ، Vibrio ، Haemophilus ، Fusobacterium و Campylobacter.
- اتخاذ تدابير وقائية مناسبة. تشكل البكتيريا والعناصر الكيميائية التي ستستخدمها أثناء الاختبار خطراً على صحتك. ارتداء نظارات السلامة ، وقفازات النتريل المتاح ومعطف المختبر عند إجراء اختبار تلطيخ. بمجرد الانتهاء من ذلك ، ضع القفازات وجميع المواد الأخرى الملوثة في كيس خاص. تذكر أن تتبع إجراءات المختبر الخاص بك للتخلص من الكيس للمنتجات الملوثة.
- ضع العينة لمراقبة على شريحة زجاجية. لبدء الاختبار ، ضع قطرة أو عينة بكتيرية على شريحة معقمة. ثم ، قم بتحريك الشفرة فوق موقد بنسن ثلاث مرات لإصلاح العينة ومنعها من الخروج من الصفيحة عند شطفها أو إضافة الكواشف.
- إضافة 5 قطرات من الكريستال الأرجواني إلى النصل. صب خمس قطرات من الحل البنفسجي الكريستال على العينة. انتظر لحظة حتى تمتص العينة البنفسجي البلوري.
- امسك الشفرة في مكانها باستخدام دبابيس ملابس حتى لا تلطخ يديك.
- اغسل الشفرة جيدًا لإزالة البقعة. استخدم حنفية أو زجاجة ضغط واترك الماء يعمل ببطء شديد لمدة تصل إلى خمس ثوان لإزالة بقايا الحبر التي لم تلتزم العينة.
- صب خمس قطرات من وصمة عار ديود غرام على الشريحة. وهو عبارة عن محلول يتكون من الصمام الثنائي ، بيكربونات الصوديوم وثاني أكسيد البوتاسيوم الذي يتسبب في إذابة اللون البنفسجي البلوري مع جدران خلايا البكتيريا. صب خمس قطرات من الحل على العينة ويترك لمدة دقيقة واحدة.
- اغسل العينة بالكحول أو حامض اللبنيك. يُعتبر الكحول والرباط عوامل التبييض ، وستقضي على تلطيخ جدران الخلايا البكتيرية إذا كانت سلبية الغرام. صب بضع قطرات من التبييض على العينة واتركها تعمل لمدة لا تزيد عن ثلاث ثوان. بعد ذلك ، حاول الشطف بلطف بالماء لمدة خمس ثوان لإزالة عوامل التبييض هذه.
- إذا سمحت للتبييض بالعمل لفترة طويلة ، فقد يؤدي ذلك إلى اختفاء تلوين البكتيريا إيجابية الجرام ، مما يؤدي إلى سلبية خاطئة.
- إجراء اختبار التباين مع safranin. Safranin هي صبغة حمراء تتناقض مع اللون البنفسجي البلوري ، وبالتالي تلوين البكتيريا التي لا تتأثر باللون الأرجواني. صب حوالي خمس قطرات من سافران على العينة وتترك لمدة دقيقة واحدة. بعد ذلك ، حاول الشطف بلطف بالماء لمدة خمس ثوانٍ.
- تصور عينتك في التكبير 1000X. سوف تصبح البكتيريا أرجوانية أو أرجوانية إذا كانت إيجابية الجرام ، أو الوردي إذا كانت سلبية الجرام بسبب سافرانين.
طريقة 2 من 3: إجراء اختبار تلطيخ زيل-نيلسن
- استخدم هذه التقنية للكشف عن البكتيريا الحمضية السريعة. تحتوي هذه الأنواع على كمية أكبر من الدهون ، مما يجعلها أكثر مقاومة للأصباغ المستخدمة في تلطيخ غرام. تنتمي البكتيريا المقاومة للأحماض إلى جنس المتفطرة ، والتي تشمل البكتيريا المسؤولة عن السل (M. السل). لصبغ بكتيريا مقاومة للأحماض ، يجب عليك استخدام صبغة حمراء تسمى الكربونية fuchsin ، ومقاومة الشطف بمحلول حامض الكبريتيك.
- اتخاذ تدابير وقائية مناسبة. يمكن أن تكون المواد الكيميائية والبيولوجية المستخدمة أثناء تلطيخ زييل - نيلسن خطرة. بالإضافة إلى ذلك ، ستحتاج أيضًا إلى استخدام مصادر الحرارة ، مثل فوهة بنسن أو سخان كهربائي أو مصباح كحول. اتبع الإرشادات أدناه لإجراء الاختبار.
- ارتد نظارات واقية ، وقفازات النتريل ومعطف المختبر.
- احرص على عدم استنشاق الأبخرة من الأصباغ والتبييض ولا تدع القطرات ترشّ عينيك أو جلدك. الحفاظ على حاويات مفتوحة تحت غطاء محرك السيارة.
- كن حذرًا جدًا عند تسخين الشفرة. معظم المواد الكيميائية المستخدمة قابلة للاشتعال. قد يكون هناك أيضًا آثار للمواد القابلة للاشتعال على الشرائح أو غيرها من المعدات.
- تحضير النصل. مع حركات دائرية ، انتشر بالتساوي كمية صغيرة من العينة البكتيرية في وسط شريحة معقمة. يجب أن تحتل عينتك حوالي 10 ملم في 20 ملم.
- تجفيف النصل. ضع الشفرة على هيكل التجفيف بحيث تكون العينة متجهة لأعلى. اتركها لتجف بشكل طبيعي لمدة 30 ثانية. لا تحاول تجفيف الشفرة بقطعة قماش.
- تأمين العينة مع الحرارة. مع العينة لأعلى ، حرك النصل مرتين أو ثلاث مرات على موقد بنسن المضاء. يمكنك أيضًا وضع الشفرة على سخان كهربائي من خلال ضبط درجة الحرارة بين 65 درجة مئوية و 75 درجة مئوية لمدة ساعتين على الأقل. احرص على عدم غلي أو حرق العينة.
- إضافة fuchsin carbolic إلى النصل. صب عدة قطرات من هذا الحل على الشريحة. صب ما يكفي لتغطية العينة تماما.
- تسخين شفرة لإصلاح الصبغة. قم بتدفئة الشريحة بعناية فوق موقد بنسن أو مصباح كحول ، مع توجيه العينة للأعلى أو وضعها على سخان كهربائي. قم بتسخين الشفرة إلى 60 درجة مئوية أو حتى تبدأ في إطلاق البخار. دع الصبغة تعمل لمدة خمس دقائق.
- إذا كنت تستخدم سخانًا كهربائيًا ، فقم بتشغيله عند 60 درجة مئوية. إذا اخترت مصباح الكحول أو موقد بنسن ، يجب أن تتوقع رؤية أبخرة.
- للحفاظ على الشفرة في درجة الحرارة المطلوبة لمدة خمس دقائق ، قم بتسخينها بشكل متقطع.
- احرص على عدم غلي أو حرق أو تجفيف العينة.
- شطف النصل بالماء البارد. اتركها لتبرد لمدة خمس دقائق وشطفها بلطف لبضع ثوان بالماء الصافي. استخدم ماء الصنبور أو زجاجة ضغط لإزالة بقع الصبغة التي لم تلتزم العينة.
- صب على عينة الكحول الحمضي أو حامض الكبريتيك. استخدام حجم 3 ٪ من حجم (ت / ت) الكحول أو 20 ٪ حامض الكبريتيك لتغطية العينة تماما. اسمح للحمض بالعمل حتى يتلاشى اللون ويصل إلى ظلال وردية مشرقة جدًا. تستغرق العملية عادة حوالي عشر دقائق.
- استخدم الماء النظيف لشطف النصل. اغسل الشفرة برفق تحت صنبور أو باستخدام زجاجة ضغط. إزالة جميع بقايا الحمض وصبغ جيدا.
- إضافة وكيل النقيض. بمجرد شطف الشريحة ، صب صبغة الملكيت الأخضر أو الأزرق الميثيلين. ينشئ هذان الحلان خلفية زرقاء أو خضراء تظهر عليها الصبغة الحمراء ، وكذلك مواد بيولوجية أخرى ، مثل الخلايا البشرية والبكتيريا المقاومة للأحماض. دع المواد تعمل لمدة دقيقة إلى دقيقتين.
- شطف وتجفيف النصل. شطف جيدا بالماء لإزالة التباين الزائد. بمجرد الانتهاء من ذلك ، قم بتجفيف الجزء الخلفي من الشفرة بقطعة قماش جافة واتركها تجف بشكل طبيعي على حامل.
- تصور عينتك في التكبير 1000X. سوف تتحول البكتيريا المقاومة للأحماض إلى اللون الأحمر أو الوردي الداكن. ستتحول البكتيريا والخلايا غير البكتيرية وقاعدة الشفرة إلى اللون الأخضر أو الأزرق.
الطريقة الثالثة: دراسة سلوك ومظهر البكتيريا
- تحليل شكل البكتيريا. بعد إجراء اختبار التلوين لتحديد ما إذا كانت البكتيريا إيجابية الجرام ، سلبية الغرام أو مقاومة للحمض ، فقد حان الوقت لتحديد الأنواع بشكل أكثر دقة. أولاً ، قم بتحليل شكل البكتيريا على الشريحة. الأشكال الثلاثة الأكثر شيوعًا هي cocci (كروية) ، حلزونات وعصابات (شكل قضيب).
- هناك العديد من المتغيرات من هذه الأشكال. على سبيل المثال ، يمكن أن تظهر البكتيريا المستديرة (الكوكسيات) في أزواج (الدبلومات) ، في السلاسل ، في أكوام أو في مجموعات من أربعة (رباعيات).
- معرفة ما إذا كانت البكتيريا الهوائية أو اللاهوائية. أخذ عينتين من البكتيريا وخلق ثقافتين منفصلتين. يجب أن يكون القمر لاهوائي (ينمو بدون أكسجين) ، بينما يجب أن يكون الآخر هو هوائي (ينمو بالأكسجين). تخزين ثقافة اللاهوائية في 35 درجة مئوية في مكان خال من الأكسجين لمدة 48 ساعة على الأقل قبل مراقبة النمو.
- إذا كانت البكتيريا تنمو في بيئة خالية من الأكسجين ، ولكن ليس عندما تتعرض للأكسجين ، فهذا يعني أنها لا هوائية.
- على الرغم من أنها تتطور في بيئة مؤكسجة ، ولكن ليس في حالة عدم وجود الأكسجين ، إلا أنها هوائية.
- عندما تتطور في كلا البيئتين ، نتحدث عن البكتيريا اللاهوائية الاختيارية.
- إجراء اختبار الحركة. البكتريا تكون متنقلة إذا كان يمكنها التحرك بمفردها باستخدام واحدة أو أكثر من السوط. تعد درجة الحركة مهمة جدًا في تحديد أنواع بكتيرية معينة. هناك عدة أنواع من الحركة ، ولكن الطريقة الأكثر أمانًا والأكثر وضوحًا هي الوسيطة شبه الصلبة.
- خلق ثقافة لاختبار الحركة. إعداد ثقافة البكتيريا في مرق الثقافة. اتبع الإرشادات أدناه لإعداد المرق من اختيارك.
- تلقيح الثقافة في أجار شبه صلبة لاختبارات الحركة. معطف جزء من ثقافة مرق بإبرة التلقيح العقيمة. زرع الإبرة بعناية في أنبوب dagar شبه الصلبة ، مثل TTC lagar ، الذي قمت بإعداده للاختبار. يجب أن تخترق الإبرة 2/3 من أجار.
- عند الانتهاء من ذلك ، قم بإزالة الإبرة بعناية ، مع الحرص على عدم تجاوز حدود منطقة التلقيح.
- احتضان الأنبوب عند 30 درجة مئوية لمدة 48 ساعة.
- قراءة نتيجة الاختبار. سوف تتحول أجار اختبار الحركة إلى اللون الأحمر عند ملامستها للبكتيريا. إذا كانت متحركة ، فسوف ينتشر هذا اللون الأحمر أو الوردي في جميع أنحاء المادة. خلاف ذلك ، سوف يقتصر تلطيخ إلى موقع الحقن.
الطريقة الرابعة: تفسير جميع النتائج
- اجمع تعليقاتك. لمعرفة نوع البكتيريا ، ستحتاج إلى جمع المعلومات التي تم الحصول عليها من الثقافات ، واختبارات التلوين ومراقبة الأشكال. إذا كنت تقوم بفحص عينات المريض ، فقد تساعد الأعراض التي تظهر فيها أيضًا في تحديد نوع البكتيريا المناسبة.
- على سبيل المثال ، إذا أظهرت الاختبارات أن البكتيريا سالبة الجرام ، ولا لاهوائية ، وغير حركية ولاحظت أعراضًا مثل آلام البطن والغثيان والقيء في المريض ، فمن المحتمل أن يعاني المريض من عدوى باكتيرويديز. الهشة.
- استشر قاعدة بيانات. هناك الآلاف من أنواع البكتيريا في العالم. من المستحيل معرفة كل شيء عن ظهر قلب. ستحتاج على الأرجح إلى الرجوع إلى كتاب علم الأحياء الدقيقة السريري أو قاعدة بيانات على الإنترنت لمقارنة نتائج الاختبار بالمعلومات عن الأنواع البكتيرية.
- هناك موارد ممتازة عبر الإنترنت لتحديد البكتيريا ، ولكن معظم قواعد البيانات هذه متوفرة باللغة الإنجليزية ، بما في ذلك Patricbrc.org و GlobalRPh. ومع ذلك ، لا يزال بإمكانك العثور على معلومات مفيدة على الموقع الإلكتروني لمركز موارد الميكروبات التابع لـ INRA.
- قم بإجراء اختبار وراثي لمعرفة الأنواع الدقيقة للبكتيريا. في بعض الحالات ، قد تحتاج إلى تحديد أنواع البكتيريا. الطريقة الأسرع والأسهل هي إجراء اختبار الحمض النووي. اختبارات الحمض النووي مفيدة أيضًا لتحديد البكتيريا المقاومة للأشكال التقليدية للتلطيخ والثقافة. في أيامنا هذه ، اختبارات الحمض النووي على الكائنات الحية الدقيقة سريعة جدًا ويمكن أن تكون جاهزة في أقل من ساعتين.
- إذا لم تتمكن من الوصول إلى مختبر يقوم بإجراء تسلسل جيني للكائنات الحية الدقيقة ، فأرسل عينة بكتيرية إلى وكالة متخصصة.